Очистка вирусных нуклеиновых кислот за один цикл
Простой метод экстракции нуклеиновых кислот позволяет быстро очистить геномную вирусную РНК и ДНК, сводя к минимуму риск перекрестного заражения.
Такие болезнетворные вирусы, как SARS-CoV-2, вирус гепатита и вирус гриппа, представляют серьезную угрозу для общественного здравоохранения. Для борьбы с вирусными вспышками вирусологи имеют решающее значение для раннего выявления присутствия вируса в популяции. Анализ нуклеиновых кислот из биологических образцов или образцов окружающей среды является предпочтительным методом вирусного надзора, поскольку исследователи могут точно охарактеризовать различные штаммы и отслеживать их эволюцию в режиме реального времени. Получение чистой вирусной ДНК или РНК из образцов обеспечивает точные результаты последующих анализов, таких как ПЦР, секвенирование и клонирование.
Типичный процесс очистки нуклеиновых кислот включает в себя четыре этапа: эффективное разрушение клеток, денатурацию нуклеопротеиновых комплексов, инактивацию нуклеаз и удаление загрязнений. Хотя протокол прост, на каждом этапе возможны ошибки, которые могут снизить качество и количество конечного продукта. Коммерческие наборы для экстракции нуклеиновых кислот, использующие протоколы на основе растворов или колонок, сокращают количество этапов рабочего процесса, позволяя исследователям выделять вирусную ДНК или РНК из биологических образцов со средней или высокой производительностью.
Некоторые молекулярные биологи до сих пор используют фенол-хлороформную экстракцию на основе органических растворителей для очистки нуклеиновых кислот. Хотя этот метод часто позволяет получать чистые образцы, он трудоемок, имеет низкую производительность и приводит к образованию опасных жидких отходов. Другим ключевым недостатком этого метода является то, что неполное разделение фаз между жидкостями снижает выход, затрудняя извлечение геномного материала из образцов с низкой вирусной нагрузкой.
В большинстве коммерческих наборов используется твердофазная экстракция, при которой нуклеиновые кислоты связываются с твердой матрицей в зависимости от сродства или размера. При аффинной очистке диоксида кремния отрицательно заряженные молекулы нуклеиновых кислот связываются с положительно заряженными частицами диоксида кремния, присутствующими в спиновой колонке. Эти наборы включают в себя несколько этапов, включая лизис клеток, адсорбцию нуклеиновых кислот, промывку и элюирование, прежде чем исследователи получат чистую ДНК или РНК. Хотя наборы ускоряют процесс экстракции за счет сокращения времени между этапами, риск перекрестного заражения возрастает с увеличением количества образцов. Кроме того, на нескольких этапах процесса очистки в колонне с диоксидом кремния исследователям приходится подвергать свои нуклеиновые кислоты воздействию центробежных сил, что снижает целостность продукта при последующем применении.
Из-за этих недостатков ученые ищут различные наборы для очистки, которые повышают скорость экстракции, выход, чистоту и масштабируемость при минимизации перекрестного загрязнения. Наборы для очистки односпиновых ДНК и РНК GenElute™-E используют метод хроматографии без учета размера для очистки нуклеиновых кислот и обладают рядом преимуществ по сравнению с традиционными наборами для очистки на основе диоксида кремния.
Использование различий в размерах клеточных молекул лежит в основе набора GenElute™-E для однократного отжима. Во-первых, протеазная смесь из набора переваривает белки, выделяя нуклеиновые кислоты из комплекса белок-ДНК. При прохождении через пористую колонку более мелкие биомолекулы, такие как фрагменты белков, липиды и сахара, задерживаются в порах, а более крупные молекулы ДНК и РНК проходят через колонку непосредственно в буфер для элюирования.
В наборе GenElute™-E для анализа вирусной ДНК/РНК используется технология single spin, которая обеспечивает более быструю и эффективную очистку вирусных нуклеиновых кислот из различных образцов, таких как мазки из носоглотки и гениталий, а также образцы кала. В буфере для лизиса вирусов, входящем в набор, используется протеаза SmartLyseTM для лизиса вирусных частиц в течение нескольких минут. После этапа лизиса экспериментатор отделяет клеточный дебрис центрифугированием и загружает супернатант с нуклеиновой кислотой в отдельную колонку для элюирования. Колонка очищает вирусную ДНК или РНК за один оборот, что сводит к минимуму риск перекрестного заражения при многократном пипетировании. За счет сокращения количества этапов технологического процесса набор GenElute™-E для анализа вирусной ДНК/РНК имеет дополнительное преимущество - сокращается количество пластиковых отходов.
Набор для очистки вирусов обеспечивает высокий выход чистых нуклеиновых кислот без каких-либо химических примесей из хаотропных солей или органических растворителей, что идеально подходит для последующих применений, таких как КПЦР, мультиплексная ПЦР и секвенирование нового поколения. Межлабораторный тест показал, что имеющиеся в продаже наборы для ПЦР-анализа SARS-CoV-2 успешно амплифицируют транскрипты вирусной РНК, выделенные с помощью набора GenElute™-E для анализа вирусной ДНК/РНК. Таким образом, набор для выделения РНК, который завершает экстракцию всего за пять минут при минимальном обращении с образцами, привлекателен для ученых, изучающих распространение SARS-CoV-2 и появление новых вариантов.
